NK细胞无需抗原预先致敏，即可快速反应并同时激活免疫系统来协同发挥杀伤作用，堪称免疫细胞里的航空母舰。科学家对NK细胞疗法也寄予厚望，全球的NK细胞相关疗法也在如火如荼的进行着。如何高效利用NK细胞帮助我们战胜疾病，科学家们为此一直在努力着，而提高NK细胞的纯度，便得以达到更好的治疗效果。
Fig1：NK 细胞的来源
细胞疗法在临床肿瘤治疗上的颠覆性成功显示其巨大的潜力。而NK细胞是杀伤肿瘤细胞的重要效应因子，随着科学家的不断探索和研究，它的应用也越来越受到关注。由于NK细胞不受MHC限制，故其不会引起移植物抗宿主病的优点被广受青睐。再者由iPSC分化而来NK细胞还可以实现批量化生产，提高生产效率。这使得NK细胞成为开发“现货型免疫疗法”的高潜力细胞。
技术与产品持续创新与突破
在对NK细胞不断的探索中，细胞的表型和功能鉴定是不可或缺的关键步骤。譬如，获取足够数量、高纯度且高活力的NK细胞是保证治疗效果的关键，2023年3月1日，上海吉涛生物科技有限公司针对NK细胞的纯度进行差异化创新产品,截止2024年1月12日,其纯度可达到99%。培养详细进程如下:
细胞培养
培养室验室外部照片实拍：
培养过程的照片：
图片标注：NK细胞培养的第三天，显微镜下的细胞生长分布，密度情况。
NK近99%纯度报告：
图片标注：通过第三方流式检测后的报告，NK细胞标志物CD3-CD56+显示达到了97.41%。
关于提纯和培养：
提取PBMC
NK细胞的培养是从人体的外周血单个核细胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）开始的，而PBMC需要从健康人的血液中尽快进行处理并分离提取。采血使用的是肝素钠采血管，我们需取约40-50ml血液进行一份NK细胞的培养，也会按献血人的年龄、身体情况等不同有区别，一般在采血后送达实验室，实验室便进行处理。脐血CBMC（Cord Blood Mononuclear Cell）可通过采血袋进行采集。我们处理血液分离细胞使用的是Ficoll®梯度离心分离法，另外灭活并保存血浆。
培养概述
本实验室通过接近17天的培养流程将约5kw的PBMC培养成1m/ml的NK细胞约2600ml。全程使用的是进口培养基、试剂，进口耗材。在PBMC分离后，用生理盐水重悬，取少量细胞进行计数，使用约3*10^7 - 5*10^7进行以下处理。如有剩余可另行冻存。
制备使用的培养基。培养细胞时培养基的选择至关重要，我们采用的是进口的无血清免疫细胞培养基，里面包含的营养成分足够在正常培养条件下促进细胞生长与扩增。细胞培养基中加入的刺激剂可诱导NK细胞的增值与分化。同时我们所添加的试剂因子可提高NK细胞的杀伤作用和活性。
取在培养步骤用包被液包被并保存在4°24h的T75瓶，弃包被液，用9ml加入了激活的培养基重悬细胞，1ml自体灭活血浆和保密试剂，放入培养箱37，5%CO2浓度培养。之后隔天观察，并在细胞处于可处理的状态时，及达到理想的扩增密度约为1-2*10^6/ml时，可加液补充。
培养过程中，当液体体积与密度到达可换T175瓶时从原本的T75瓶内转出，再正常培养；之后在液体体积到达可换培养袋时将细胞及液体转入。
在Day18左右，NK细胞达到理想的数量时（可取少量细胞悬液进行计数）可进行离心收集，并检测细胞悬液NK细胞含量成分及纯度。
上图报告为2023年3月的一次NK细胞培养Day18时送至第三方流式检测形成的细胞类型分布。本案例中我们可以看到NK细胞标记物CD3-CD56+（97.41%），达到了近99%的培养水平。时至今日,除了NK细胞的制备,TILs细胞在此基础上更进行迭代更新,新的数据显示tils现可制备1200亿-2400亿, 再创新高。
据吉涛生物创始人刘天津介绍，TIL疗法已在治疗宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胆管细胞癌、卵巢癌、胰腺癌等临床试验中取得令人可喜的疗效数据。TIL疗法是一个适应症覆盖面非常广的疗法，对于多种类型的实体肿瘤都能产生不错疗效。而吉涛生物新型的DC-TIL疗法将突破传统制备上的细胞数量,利用新型诱导技术和激活方式让战斗的细胞数值达到2400亿单位量。
TIL疗法治疗实体瘤
TIL疗法在实体瘤中取得的疗效基于其具有优势：
靶向性强：来自于肿瘤组织的TIL主要由效应记忆T细胞(Tem)组成，表面表达的趋化因子受体(如CCR5、CXCR3)联合多种肿瘤特异性TCR，在TIL输注后，可以准确靶向肿瘤新生抗原；
肿瘤浸润能力强：TIL细胞来自肿瘤，肿瘤趋化因子受体高表达，合适的趋化因子受体系统，使得TIL回输后可更好地浸润肿瘤组织；
安全窗口高：天然TCR识别，耐受高达10E11级的回输剂量，安全窗口非常宽，仅识别肿瘤细胞抗原，不会靶向自身正常细胞，临床上显示良好的安全性；
疗效持久：TIL细胞中记忆性T细胞比例高，是非选择的肿瘤特异性杀伤T细胞，靶向多种抗原，可克服因靶点丢失引起的复发问题。2012年接受TIL疗法的幸存者Melinda，目前已成功存活11年。
技术创新对突破TIL疗法 技术壁垒极为重要
吉涛生物的科学家们为了在鱼龙混杂的体系之中提纯出NK细胞进行了数十年的研究，但各种方法都存在自己的优越性以及局限性，这就需要我们学会理性分析自己的需求特点，选择合适的提纯方案，并在实践中不断优化和改进技术。我国的NK细胞疗法起步虽然略慢，但是我们充分利用了产业模式以及广纳新的科学技术，发展出许多NK细胞提纯的平台，为我国NK细胞相关研究和应用保驾护航。在疫情阴霾完全散去的今天，我国的免疫治疗领域正如NK细胞本身一样，在监管反应和协同方面同时发力，为战胜疾病贡献自己的力量。
